Tahapan Ekstraksi Dan Amplifikasi DNA Barcoding Ikan Trichogaster Trichopterus

| |

Tricogaster trichopterus atau sering disebut sepat biasa dan biasa orang bangka bilang sepat rawa adalah sejenis ikan anggota suku gurami(Osphronemidae) dan biasanya ditemui di perairan tawar, seperti rawa, sungai, dan danau, di beberapa wilayah Asia Tenggara. Sepat rawa memiliki ciri-ciri fisik tertentu, seperti warna cokelat dan pola tubuh yang khas, dan sering dijadikan ikan hias dalam akuarium air tawar. sepat rawa(Trichogaster  trichopterus)merupakan  ikan  air  tawar  yang  memiliki  nilai ekonomis  sebagai  sumber  protein.  Upaya  nelayan  hanya  mengandalkan  hasil  tangkapan dari alam dengan melakukan penangkapan terus-menerus, sehingga hal ini dikhawatirkan dapat  menimbulkan  dampak  negatif  terhadap  populasi  sepat  rawa  di  perairan  rawa Bangka (Supeni, E. A.,et.al 2020). dan menyimpan salah satu spesies ikan menarik dalam ikan hias untuk diteliti Trichogaster trichopterus. Dalam upaya untuk lebih memahami spesies ikan ini harus lebih kuat menjaga kelestariannya, para peneliti sudah memulai untuk melakukan ekstraksi DNA barcoding yang menarik untuk ikan sepat.

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) atau asam nukleotida, biasanya dalam bentuk heliks ganda yang mengandung instruksi genetik yang menentukan perkembangan biologis dari seluruh bentuk kehidupan sel. Ekstrasi DNA merupakan suatu teknik untuk memisahkan DNA dari molekul atau organel lain yang tidak diperlukan. Proses ini sangat menentukan kualitas DNA yang akan dihasilkan. Prinsip dasar Ektraksi DNA adalah menghancurkan membran dan dinding sel kemudian mengekuarkan DNA yang terdapat didalam nukleus dan mitokondria tanpa menyebabkan kerukasan DNA (Siswoyo, A. B. 2019).

Ekstraksi DNA memiliki banyak manfaat penting, termasuk:

● Penelitian Genetika: Memungkinkan penelitian untuk mengisolasi DNA untuk memahami dasar genetik organisme, mengidentifikasi gen tertentu, dan melakukan penelitian ilmiah.

● Diagnostik Medis: DNA ekstraksi digunakan dalam diagnostik penyakit genetik, identifikasi mikroorganisme patogen, dan deteksi mutasi genetik yang terkait dengan penyakit.

● Kriminologi dan Forensik: Penting dalam analisis bukti forensik, seperti mencocokkan DNA dari tempat kejadian perkara dengan sampel DNA tersangka.

● Bioteknologi: DNA ekstraksi digunakan dalam rekayasa genetika untuk menghasilkan organisme yang dimodifikasi secara genetik, seperti tanaman transgenik.

● Pengembangan Obat: Dalam penelitian obat, ekstraksi DNA membantu dalam pemahaman tentang sasaran genetik yang terlibat dalam penyakit dan pengujian obat.

● Klasifikasi dan Identifikasi Organisme: Berguna dalam taksonomi dan identifikasi organisme, termasuk spesies mikroba yang penting dalam lingkungan dan industri.

● Produksi Vaksin dan Terapi Genetik: DNA ekstraksi berperan dalam pengembangan vaksin dan terapi genetik yang memerlukan isolasi DNA spesifik.

● Pelacakan Asal Usul dan Hubungan Keluarga: Digunakan dalam penelitian kekerabatan dan sejarah keluarga untuk melacak garis keturunan dan asal-usul.

Ekstraksi DNA secara umum memiliki tahapan-tahapan yang meliputi isolasi dari jaringan, pelisisan dinding dan membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi serta presipitasi atau pemadatan. Dalam prosesnya terdapat empat proses ekstraksi DNA, yaitu proses eksraksi lisis,binding,wasting, dan elution. Berikut ini tahapan-tahapan proses melakukan ekstraksi proses ekstraksi:

1. Lisis ( pemecahan), 20-25 mg jaringan, jaringan yang sudah ditimbang di masukkan ke mikrotube 1,5  dan ditambahkan buffer GT1 lalu digerus menggunakan mikropastel, lanjut ke homogenitas kemudian ditambahkan proteinase k, setelah selesai menambahkan proteinase k langsung vortex setelah vortex ditambahkan buffer GT2 200 microlite.
2. Binding( pengikatan), inkubasi 15⁰ C selama 10 menit, selanjutnya ditambahkan etanol obsolute 200 mikrolite habis itu vortex, setelah vortex masukkan kedalam spin kolom,lanjut ke sentrifuge 1 menit 13.000 rpm terakhir dibuang larutan yang ada dispin kolom.
3. Washing ( pencucian), ditambahkan 500 mikrolite buffer W1,habis itu sentrifuge 1 menit 13.000 rpm, selanjutan buang larutan yang dikolom spin kolom, setelah itu ditambahkan 700 mikrolate W2 , sentrifuge 2 menit 13.000 rpm, buang kolom yang ada dispin kolom, ganti dengan tube baru 1,5 ml.
4. Elution ( terfurifikasi), ditambahkan 50 mikrolite elution buffer, lanjut inkubasi selama 2 menit, sentrifuge 1 menit 13.000 rpm, terakhir simpan disuhu - 20⁰C.

Ampilifikasi DNA barcoding ikan adalah proses memperbanyak fragmen DNA dari sampel ikan menggunakan teknik seperti polymerase chain reaction (PCR). Ini memungkinkan pengambilan fragmen DNA yang khas dari spesimen ikan untuk kemudian diidentifikasi dan digunakan dalam analisis identifikasi spesies ikan. DNA barcoding adalah metode penting dalam taksonomi molekuler dan konservasi biodiversitas.

Tujuan amplifikasi DNA barcoding ikan adalah:

●Identifikasi Spesies: Memungkinkan identifikasi spesies ikan dengan cara mendeteksi fragmen DNA yang khas dari setiap spesies. Hal ini penting untuk mengidentifikasi ikan dalam berbagai konteks seperti penelitian ilmiah, manajemen sumber daya ikan, dan pencegahan perdagangan ilegal ikan.

●Klasifikasi Taksonomi: Membantu dalam penentuan taksonomi dan klasifikasi ikan, terutama ketika spesimen fisik tidak lengkap atau rusak.

Studi Ekologi: Memberikan wawasan tentang keragaman genetik dalam populasi ikan, yang dapat digunakan untuk studi ekologi populasi, pemahaman pola migrasi, dan dinamika populasi.

●Konservasi Biodiversitas: Mendukung upaya konservasi dengan mengidentifikasi spesies yang rentan atau terancam punah.

●Pengembangan Database Genetik: Membangun database referensi DNA barcoding ikan yang dapat digunakan untuk membandingkan sampel tak dikenal dengan spesies yang telah teridentifikasi.

●Pemantauan Keaslian Produk: Membantu dalam memastikan keaslian produk-produk perikanan dan mencegah pemalsuan dengan memeriksa label spesies ikan yang diklaim dalam produk ikan. Dengan demikian, amplifikasi DNA barcoding ikan memiliki banyak aplikasi dalam ilmu pengetahuan, konservasi, dan pengelolaan sumber daya ikan.

           

Tahapan pada amplifikasi PCR yaitu :

1. Denaturasi
2. Analing
3. Ekstensi/ elongnasi

Suhu denaturasi berkisar antara 93 sampai 95⁰ C, ini semua tergantung pada panjang panjang DNA  template  yang digunakan dan juga pada panjang fragmen DNA target. Suhu denaturasi yang terlalu tinggi akan menurunkan aktivitas polimerase DNA yang akan berdampak pada efisiensi PCR. Selain itu juga dapat merusak DNA templat, sedangkan suhu yang terlalu rendah dapat menyebabkan proses denaturasi DNA templat tidak sempurna. Pada umumnya suhu denaturasi yang digunakan adalah 94o C.

            Secara umum suhu annealing yang digunakan berkisar antara 37 - 60o C. Pemilihan suhu annealing berkaitan dengan Tm primer yang digunakan untuk proses PCR. Suhu annealing yang digunakan dapat dihitung berdasarkan (Tm – 5)o C sampai dengan (Tm + 5)o C. Dalam menentukan suhu annealing yang digunakan perlu diperhatikan adanya mispriming pada daerah target dan nontarget, dan keberhasilan suatu proses PCR akan ditentukan oleh eksperimen.

            Proses ekstensi primer pada proses PCR selalu dilakukan pada suhu 72o C karena suhu tersebut merupakan suhu optimum polimerase DNA yang biasa digunakan untuk proses PCR.

                  

Penulis : Subriyono(2062211030)